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〈大腸桿菌電轉化製備感受態細胞〉-【科學實驗-討論區-www.coi.tw 】

作者 : 科學實驗
性別 : 男
文章主題 : 大腸桿菌電轉化製備感受態細胞 人氣指數 : 1502
發表時間 :2013/11/9 上午 11:54:11   


相片:大腸桿菌電轉化製備感受態細胞
http://www.tw17.com.tw/viewboard.asp?articleid=20131109115410

大腸桿菌電轉化感受態細胞製備流程及轉化方法

1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置於LB或其他營養豐富的培養基上,在37攝氏度下過夜培養
2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用
3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升),保存於<a href=http://www.tw17.com.tw/pro_list.asp?class3_ser=20><font color='#FF0000'><u>冷凍室</u></font></a>中以備第二天重懸浮細胞用第二天:
4. 轉移0.2-1ml過夜培養物至裝有500ml LB(或其他營養豐富的培養基)的1-2升搖瓶
5. 37攝氏度下劇烈振盪培養2-6小時
6. 定時監控OD600值(培養1小時後每半小時測定一次) 
7. 當OD600值達到0.5-1.0時,從搖床中取出搖瓶,置於冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養液數小時)8. 細胞在4攝氏度5000g下離心15分鐘,棄上清液(如需要,沉澱可在4攝氏度的10%甘油中保存一兩天)9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞於少量體積中(幾毫升),然後加水稀釋至離心管的2/3體積。
10. 照上面步驟重複離心,小心棄去上清液11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞
12. 離心,棄上清液
13. 用20ml滅菌的、冰冷後的10%甘油重懸浮細胞
14. 照上面步驟離心,小心棄去上清液(沉澱可能會很鬆散)
15. 用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml
16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管,於-80攝氏度保存

轉化方法:
1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA,冰上培育約5分鐘
2. 添加1-3μl DNA,冰上培育約5分鐘
3. 轉移DNA /細胞混合物至冷卻後的2mm電穿孔容器(無泡)中
4. 加載P1000,準備好300μl LB 或2xYT
5. 對電穿孔容器進行脈衝(200 歐姆, 25μFd,2.5 千伏)(檢查時間常數,應該在3以上)
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中
7. 37攝氏度下培養細胞40分鐘至1小時以復原
8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養

大腸桿菌電轉化製備感受態細胞

大腸桿菌電轉化感受態細胞製備流程及轉化方法

1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置於LB或其他營養豐富的培養基上,在37攝氏度下過夜培養
2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用
3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升),保存於冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用第二天:
4. 轉移0.2-1ml過夜培養物至裝有500ml LB(或其他營養豐富的培養基)的1-2升搖瓶
5. 37攝氏度下劇烈振盪培養2-6小時
6. 定時監控OD600值(培養1小時後每半小時測定一次)
7. 當OD600值達到0.5-1.0時,從搖床中取出搖瓶,置於冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養液數小時)8. 細胞在4攝氏度5000g下離心15分鐘,棄上清液(如需要,沉澱可在4攝氏度的10%甘油中保存一兩天)9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞於少量體積中(幾毫升),然後加水稀釋至離心管的2/3體積。
10. 照上面步驟重複離心,小心棄去上清液11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞
12. 離心,棄上清液
13. 用20ml滅菌的、冰冷後的10%甘油重懸浮細胞
14. 照上面步驟離心,小心棄去上清液(沉澱可能會很鬆散)
15. 用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml
16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管,於-80攝氏度保存

轉化方法:
1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA,冰上培育約5分鐘
2. 添加1-3μl DNA,冰上培育約5分鐘
3. 轉移DNA /細胞混合物至冷卻後的2mm電穿孔容器(無泡)中
4. 加載P1000,準備好300μl LB 或2xYT
5. 對電穿孔容器進行脈衝(200 歐姆, 25μFd,2.5 千伏)(檢查時間常數,應該在3以上)
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中
7. 37攝氏度下培養細胞40分鐘至1小時以復原
8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養



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